系统化评估功能化三嵌段聚合物F127-PDL的一步修饰以培养神经元细胞。
Introduction
思路：
- 聚二甲基硅氧烷（PDMS）是一种广泛使用的硅基聚合物，可用于从人造橡胶、医疗器械、表面活性剂到润滑剂以及日常生活中的各种应用（例如使头发光滑的洗发水和用于消泡的食品）。近年以来，PDMS成为了微流控芯片（即芯片实验室）中最常用的材料之一。在生命科学领域，如细胞/组织微工程，PDMS材料价格低廉、柔韧、化学惰性、光学透明、对细胞无毒、不透水、透气、微原型设计和制造方便，使其有利于在微观尺度上进行各种生物学研究。然而PDMS表面具有疏水性和细胞排斥性，导致哺乳动物细胞（特别是对细胞外微环境非常敏感的神经元细胞）的粘附和培养效果较差，极大地降低了PDMS微系统（如基于细胞的微平台和芯片）的细胞兼容性。因此，需要开发一种有效的表面改性方法，以促进细胞在PDMS相关界面上的粘附，从而扩展基于细胞培养的微工程应用。
- 目前修饰PDMS以建立细胞粘附表面的方法通常分为物理涂层和化学耦合两大类。PDMS表面上的诸如胶原蛋白、层粘连蛋白和聚赖氨酸到的物理涂层可以改善细胞粘附，但无法在长期培养中维持，即粘附稳定性低。形成粘附性PDMS界面的化学耦合非常稳定。然而由于PDMS的化学惰性，往往需要多步策略和有机溶剂、氧化剂或潜在有毒反应物的使用，这阻碍了在细胞微工程和生物医学微系统中开发PDMS粘附涂层。因此，有必要构建一种简单、有效且实用的方法，以在PDMS表面上实现稳定且持久的细胞粘附/培养。
- 在此，作者发展了一种基于使用多聚赖氨酸偶联的Pluronic F127（F127-PDL，一种功能化的三嵌段聚合物）进行极为简单的PDMS表面修饰处理（即一步式修饰），并促进神经元在PDMS基底上高效粘附和培养的新方法。
- 在这项研究中，为了确认在PDMS材料上操纵微环境敏感神经元的稳健性能，作者系统地研究了通过已建立的易于操作的F127-PDL处理工艺修饰的PDMS表面上的神经元细胞粘附和培养。并对原代神经元细胞的粘附（细胞密度和面积）、分化（轴突-树突形成、轴突分支、树突和多树突生成）和生长（轴突和树突伸长）以及其在未修饰的PDMS和F127-PDL、F127、聚-D-赖氨酸（PDL）或聚-L-赖氨酸（PLL）修饰的PDMS表面对以及涂有PDL或PLL的聚苯乙烯（PS）表面上的培养进行了综合评估。此外，基于光学、荧光和免疫细胞化学检测分析了神经元细胞在F127-PDL修饰的PDMS表面上长期片上和片外培养期间与粘附、活力和神经元网络形成相关的细胞活动。同时，还对不同修饰的PDMS和PS表面之间的长期神经元细胞培养进行了比较评估。
Neuronal Cell Adhesion on F127-PDL-Modified PDMS
F127-PDL分子具有PDL基团基于静电相互作用增强神经元粘附的能力和F127基团基于疏水相互作用牢固吸附到PDMS界面上的能力。与PDL涂层相比，F127-PDL修饰可实现更稳定的神经元细胞粘附和长时间培养。
PDMS（绿）、F127-PDL修饰的PDMS（红）的傅立叶变换衰减全反射红外（ATR-FT-IR）光谱和F127-PDL（黄）的傅立叶变换红外（FT-IR）光谱。结果表明，F127-PDL修饰的PDMS表面的化学成分包含原始F127-PDL和天然PDMS表面的化学成分，F127-PDL分子很好地涂覆在PDMS基底上。
PDMS、F127-PDL修饰的PDMS、F127修饰的PDMS和PDL修饰的PDMS基底的水接触角。
F127-PDL修饰的PDMS表面在修饰后不同时间点（0、1、3、6和12 d）的接触角。
- （A-B）用未修饰的PDMS基底上的神经元细胞培养物作为空白对照，评估修饰的PDMS基底（带有F127-PDL、F127、PLL或PDL，A）和修饰的PS基底（带有代表性的修饰分子PLL或PDL，B）上原代神经元细胞的培养结果的白光图。
- （C）培养0.5 d后，在不同的PDMS和PS基底上附着的神经元细胞的密度（上）和面积（下）。
Neuronal Cell Differentiation and Growth on F127-PDL-Modified PDMS
- （A-D）培养1 d后，不同PDMS和PS基底上神经元细胞分化和生长的量化。包括轴突-树突分化（A）、轴突分支（B）、树突生成（C）、多树突生成（D）。
- （E-F）轴突生长（E）和树突生长（F）的量化。
Neuronal Cell Culture on F127-PDL-Modified PDMS
- （A）原代神经元细胞在不同基底上的白光图像。
- （B-C）培养3 d和7 d后，附着在不同基底上的神经元细胞的密度（B）和面积（C）。
PDL/PDMS、F127-PDL/PDMS和PDL/PS基底上培养7 d内的神经元细胞活性。
F127-PDL/PDMS和PDL/PS基底上培养7 d后的神经元细胞的免疫细胞化学特征。轴突（SMI-312）和体树突（MAP2）被免疫细胞化学染色。用Hoechst 33258标记细胞核。
Microfluidic Neuronal Cell Culture Based on F127-PDL Modification
- （A）神经元细胞在芯片中培养7 d后的光学和荧光图像。通过FDA/PI染色验证了微流控神经元培养物的高活性。轴突（SMI-312）、躯干树突（MAP2）和细胞核（Hoechst 33258）使用免疫细胞化学染色进行了表征。
- （B-C）在微流控芯片（即F127-PDL/PDMS芯片）中的F127-PDL/PDMS表面与芯片外的F127-PDL/PDMS或PDL/PS表面的神经元细胞粘附（B）和分化（C）的比较分析。
Conclusions
在本案例中，提出了基于使用多聚赖氨酸偶联的Pluronic F127（一种功能化的三嵌段聚合物）进行极为简单的PDMS表面修饰处理（即一步式修饰），并促进神经元在 PDMS基底上高效粘附和培养的新方法。
通过对与F127-PDL/PDMS或其他改性基底上的粘附、分化和生长有关的各种神经细胞活动进行了比较和全面的研究，从多个方面证明了F127-PDL在PDMS上培养过程中对细胞数量和延伸性的稳定粘附、高分化和存活率以及明显的神经元生长和网络形成的积极影响，这比常用的PDL和PLL在PDMS或标准PS界面上的一步处理要强，验证了F127-PDL辅助的PDMS上的微流控长期神经元培养是相当可行和高效的。
Reference
Liu W, Sun M, Han K, et al. Comprehensive Evaluation of Stable Neuronal Cell Adhesion and Culture on One-Step Modified Polydimethylsiloxane Using Functionalized Pluronic[J]. ACS Omega, 2020, 5(50): 32753–32760.
